新一代高通量测序技术可精准治疗白血病

近几年，新一代高通量测序技术（next-generation sequencing  technology，NGS)又称下一代测序技术在白血病克隆演变、诊断、预后分析、疗效评价、复发预测以及药物开发等方面得到广泛应用，新的进展层出不穷。本文仅就应用NGS技术在白血病克隆演变、预后分析和疗效评价等方面取得的新进展作一介绍。

一、白血病的克隆演变

白血病的克隆演变和遗传异质性代表了肿瘤发生、发展的规律，揭示这一规律对于预防预测疾病的发展，针对性的选择治疗方案至关重要。近年来，利用NGS技术，人们发现白血病的发生、发展是一个缓慢而复杂的过程。正常人就已经存在克隆造血。Xie等利用NGS分析了2728例血液学正常的非血液系统实体肿瘤患者外周血细胞中77个血液肿瘤相关基因。检测发现，83%的突变来自于白血病、淋巴瘤相关的19个基因，大部分等位基因突变分数较低（2%~10%），提示造血细胞克隆处于扩张的早期阶段。Genovese 等对12380例非白血病患者随访了2~7年，发现65岁以上老人的克隆造血达10%。Jaiswal等对17182例糖尿病患者进行了全外显子测序（WES）测序，发现40岁以下人群几乎没有体细胞的突变发生，而70~79岁人群中体细胞突变达到9．6%，80~89岁人群达到11．7%，90岁以上人群达到18．4%。这些研究都说明了克隆造血是经常发生的且随着年龄的增加而增加。

克隆造血的增加与白血病发生危险度的增加密切相关。鉴于血液学指标正常人群中血液肿瘤相关基因突变的高发生率且突变基因对携带者预后的影响尚不明确，借鉴意义不明的单克隆B细胞增多症和意义未明单克隆免疫球蛋白血症的诊断思路，Steensma等采用CHIP这个新的诊断名称来描述骨髓或外周血细胞具有恶性血液病相关基因突变但患者血细胞计数正常或仅合并不符合骨髓增生异常综合征（MDS）的低血细胞诊断标准的轻度减少（或称为无意义的血细胞减少）的个体。由于基因突变率的高低与采用的检测方法敏感度有关，如采用深度测序法，则几乎每个健康人均可检测到1个以上基因突变，故规定CHIP的基因突变负荷必须要达到等位基因突变分数≥2%。可作为CHIP诊断依据的突变基因谱尚无明确界定。与血液肿瘤发生密切相关的驱动基因以及其他已经在各种血液肿瘤中发生的重现性基因突变可作为诊断依据。常见的DNMT3A、TET2、JAK2、SF3B1、ASXL1、TP53、CBL、GNB1、BCOR、U2AF1、CREBBP、CUX1、SRSF2、MLL2、SETD2、SETDB1、GNAS、PPM1D和BCORL1/2突变基因可作为诊断CHIP的依据。

到目前为止，所有常见的白血病的基因突变谱，如急性髓细胞白血病（AML），MDS，急性淋巴细胞白血病（ALL），多发性骨髓瘤（MM），慢性淋巴细胞白血病（CLL）等都被揭示，而且更重要的进展是主要的白血病的克隆演变规律也逐渐呈现在我们面前。Ding等通过对8例AML患者治疗前和复发后全基因组测序（WGS）基因突变谱的比较，发现与复发相关的主要有2种克隆，一种是AML本身就有的克隆，包含多种突变基因。一种是治疗后又新产生的亚克隆，这种克隆包含着新的突变基因。AML患者中原始产生的白血病克隆不单单只有1 种，而是多种。化疗可以消灭某些AML克隆，但无法消灭导致复发的AML克隆。

WGS检测表明，白血病细胞可以有数十个，数百或者上千个基因异常，但大多数属于“过客基因”，只有少量起关键作用的“驱动基因”是AML发生、发展的必须基因。

Schuh等利用WGS，在3例CLL患者中发现其中1例在疾病发展过程中维持原克隆不变，但另外2例却逐渐出现与优势克隆相伴行的新克隆。LanDau等应用WES，对149例CLL进行突变检测发现，部分基因异常如13q缺失存在于大部分CLL患者中，且在疾病的早期就存在。而TP53、SF3B1和ATM 等仅存在部分克隆中，表现出亚克隆的特征。在治疗过程中出现的这些亚克隆与患者预后不良有关。除此之外，Rossi等还发现，原少量的伴TP53突变的亚克隆，经过治疗等因素阳性选择后，取代原有的优势克隆，成为导致复发的优势克隆。OJha等通过对12例CLL深度测序还发现，33%患者的优势克隆仍然存在，而67%患者的优势克隆在治疗过程中发生变化，这些结果说明CLL在疾病进展过程中存在2种主要的克隆演变模式，即线性进展模式和分支模式。

Bolli等分析了67例MM 从初始诊断到复发过程的克隆演变模式，种是不同时间点MM克隆的比例和突变都没有发生改变，种是克隆的突变谱没有改变但克隆的比例发生了改变，第三种是患者在复发时在原有克隆的基础上又产生了新的克隆，第四种是患者在复发时原来的克隆有丢失，而且还产生了2个以上的新的克隆。

MaKishima等利用WES和靶向测序技术动态检测122例MDS患者从诊断到发展为继发AML（sAML）造血克隆的演变过程，发现从低危MDS到高危MDS，从高危MDS到sAML，患者的基因突变和克隆造血多，有的并伴随睡眠克隆。此外，该研究还发现，如果低危MDS患者中出现一类基因突变，如TP53、RUNX1、STAG2、KRAS、ASXL1、ZRSR2和TET2，则患者很快发展为高危MDS。如果高危MDS患者出现另一类基因突变，如FLT3、PTPN11、IDH2、NPM1、IDH1 和NRAS，则患者很容易进展为sAML。

上述研究成果进一步说明，白血病的克隆演变过程是一个顺序性、多步骤基因突变的积累过程，是多基因、多克隆受到多种因素调控的过程。优势克隆的产生，正是机体内环境和药物的选择性与各种亚克隆自身适应性相博弈的结果。随着NGS测序技术的深入发展，学者们对白血病的克隆演变过程有了更加深入的认识，而且这种认识还在不断地深化。这必将使白血病的诊断和治疗模式发生翻天覆地的变化。

二、危险度分层和预后判断

影响白血病预后的因素很多，包括患者的年龄、体能评分、染色体核型、融合基因或突变基因以及微小残留病（MRD）等。近几年，通过对各种白血病基因谱的分析发现，遗传学的异常改变对白血病患者的长期生存影响很大，以AML为例，Elli等通过数学模型计算1540例AML的基因谱对其10年长期生存的影响进行分析，结果发现融合基因、基因拷贝、点突变以及基因与基因之间相互作用的异常对患者长期生存的影响为62%。而且，不同种类的遗传学改变对患者预后的影响差别很大。Ley等对200例初诊AML患者进行了WGS，WES，RNA序列和DNA 甲基化分析，在这些患者中发现了迄今已经发现的和尚未发现的融合基因和突变基因。他们将这些基因改变其按功能分为9类：转录因子融合基因（18%），核糖体基因（NPM1）（27%），抑癌基因（16%），DNA甲基化相关基因（44%），信号传导通路基因（59%），染色质修饰基因（30%），髓系转录因子基因（22%），黏连蛋白复合体基因（13%）和剪切体复合体基因（14%）。Elli等对3项前瞻性临床试验的1540例AML患者进行NGS测序。他们利用数学生物统计对患者的异常遗传学改变进行分析，并根据患者的预后，将其分为11个亚型，包括t（15：17），t（8：21），inv（16），MLL融合基因，t（6：9），NPM1，CEBPABis，TP53，染色质-剪切体，IDH2R172 等。

MaKishima等分析了401例MDS患者的基因谱和克隆演变规律，并根据患者的预后将MDS患者分为4类，Ⅰ类包括1型突变基因：FLT3、PTPN1、IDH1、NPM1、NRAS等，其5年无进展生存（PFS）为30%；Ⅱ类包括2型突变基因：TP53、GATA2、KRAS、RUNX1、STAG2、ASXL1、ZRSR2和TET2等，其5年PFS为60%；Ⅳ类为SF3B1突变，其5年PFS为100%；Ⅲ类为其他，其5年PFS为80%。

在大样本多中心临床试验中引入NGS技术，还可以研究白血病各亚型中基因与基因之间的相互作用对预后的影响。如融合基因与突变基因，突变基因与突变基因相互作用的模式。Elli通过多参数预后分析发现，TP53，FLT3，BRAF，SRSF2，AXSL1，ZRSR2，RUNX1为立的不良预后基因，而NPM1，CEBPABis，IDH2为预后好的突变基因。NPM1 如伴有FLT3 和DNMT3A，MLLPTD 伴FLT3，DNMT3A伴IDH2R140则预后明显不佳，而STAG2伴IDH2R140，NPM1 伴FLT3TKD 和DNMT3A伴RAD21的AML患者预后则明显良好。

这些结果进一步说明基因与基因相互作用的复杂性。Nicolas等对106例t（8；21）和109例inv（16）AML 进行了NGS 检测，结果发现，按照AML的8种功能分类，二者与酪氨酸激酶活化相关的基因突变，如KIT，N/KRAS，FLT3等都频发。t（8；21）患者染色质修饰相关基因突变和黏连蛋白复合物基因突变频发，分别为42%和18%，而inv（16）后者这二种基因突变几乎没有发生。高表达cKIT的CBFβ-AML患者的预后不佳，而高表达N/KRAS患者，如果不伴有KIT和FLT3基因突变则预后好。酪氨酸激酶活化相关的基因突变t（8；21）患者，如伴有染色质修饰相关基因和黏连蛋白复合物基因突变，则预后不佳，极易复发，5年复发率达60%。类似情况也发生在正常核型患者中NPM1与FLT3-ITD之间的相互作用。新的2017年ELN 关于AML危险度分类显示，NPM1突变伴FLT3-ITD低表达的（＜50%）患者属于低危，而NPM1 突变伴FLT3-ITD 高表达的（＞50%）属于中危，NPM1野生型伴FLT3-ITD低表达也是中危，只有NPM1野生型伴FLT3-ITD高表达的才属高危患者。

大量多中心临床试验的结果显示，MRD是影响白血病患者预后的主要原因，是白血病无复发率和长期生存率重要的立预后因素。因此，快速、敏感、准确地检测MRD是白血病精准治疗的关键。目前，MRD检测平台主要有多参数流式细胞（MPFC）、实时定量PCR（RT-qPCR）、数字PCR和NGS技术。MPFC和RT-qPCR是目前临床上常用的检测平台。MPFC是检测白血病细胞表面的白血病相关表面抗原（LAIP）和比较与正常细胞的不同，其可用于白血病患者治疗后的疗效评价，危险度分层和复发预测，可覆盖90%以上的白血病患者，敏感性达到10-5~10-4，只是MPFC在技术上目前还没有达到标准化，需要有经验的操作者。RT-qPCR是检测白血病细胞的分子遗传学异常，如融合基因，突变基因和过表达基因。其作用与MPFC相同，可覆盖30%~60%的白血病患者，但不能检测大部分正常核型的白血病患者。

RTqPCR对不同的靶基因检测的敏感性不同，高可达到10-7~10-6。由于MRD检测技术的进步，白血病的疗效评价有了新的进展，2017年ELN关于AML的诊断和治疗指南中引入了完全缓解（CR）的新概念：CRMRD＋和CRMRD-是指诱导化疗后经MFPC 或RT-qPCR 检测MRD 为阴性的CR，因此到此水平的患者肿瘤负荷减低了104倍。NGS技术检测MRD具有与MPFC和RTqPCR相同的敏感性和高度的一致性。到目前为止，已有多个突变基因可用于AML的MRD检测，如NPM1、RUNX1、ASXL1等，IgH 重排可用于ALL的MRD检测。但大部分突变基因是否可通过NGS检测白血病的MRD，还需要进一步的研究。近年来研究发现，基于NGS可以同时定量检测成百上千低频率体细胞突变的特点，实时定量检测白血病克隆的演变过程，尤其是白血病患者中的多克隆的变化规律。这对于我们评价疗效，指导治疗，预测复发无疑意义重大。相信在不远的将来NGS作为白血病精准治疗的卫士，在白血病的诊断和治疗中发挥越来越重要的作用。